Präklinische Bewertung herstellbarer SARS

Kommunikationsmedizin Band 3, Artikelnummer: 116 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Da sich die COVID-19-Pandemie weiter weiterentwickelt, müssen neuartige Impfstoffe entwickelt werden, die leicht herstellbar sind und eine klinische Wirksamkeit gegen neu auftretende SARS-CoV-2-Varianten bieten. Virusähnliche Partikel (VLPs), die das Spike-Antigen auf ihrer Oberfläche präsentieren, bieten bemerkenswerte Vorteile gegenüber anderen Impfstoffantigenformaten; Aktuelle SARS-CoV-2-VLP-Impfstoffkandidaten in der klinischen Entwicklung leiden jedoch unter Herausforderungen wie geringer volumetrischer Produktivität, schlechter Spike-Antigendichte, durch die Expressionsplattform gesteuerter divergenter Proteinglykosylierung und komplexen Upstream-/Downstream-Verarbeitungsanforderungen. Trotz ihrer umfangreichen Verwendung für die Herstellung therapeutischer Proteine und ihrer nachgewiesenen Fähigkeit, umhüllte VLPs zu produzieren, werden Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters (CHO) selten für die kommerzielle Produktion von VLP-basierten Impfstoffen verwendet.

Mit CHO-Zellen wollten wir VLPs produzieren, die den SARS-CoV-2-Spike in voller Länge aufweisen. Affinitätschromatographie wurde verwendet, um VLPs einzufangen, die im Kulturmedium von manipulierten CHO-Zellen freigesetzt wurden, die Spike exprimierten. Die Struktur, der Proteingehalt und die Glykosylierung von Spikes in VLPs wurden durch verschiedene biochemische und biophysikalische Methoden charakterisiert. In vivo wurde die Bildung neutralisierender Antikörper und der Schutz vor einer SARS-CoV-2-Infektion in Maus- und Hamstermodellen getestet.

Wir zeigen, dass die Spike-Überexpression in CHO-Zellen allein ausreicht, um hohe VLP-Titer zu erzeugen. Diese VLPs erinnern an das native Virus, weisen jedoch eine mindestens dreifach höhere Spike-Dichte auf. In vivo lösen gereinigte VLPs bei Dosen im Nanogrammbereich eine starke humorale und zelluläre Immunität aus, die Schutz vor einer SARS-CoV-2-Infektion bietet.

Unsere Ergebnisse zeigen, dass CHO-Zellen für die effiziente Herstellung hoher Titer eines stark immunogenen VLP-Impfstoffantigens auf Spike-Protein-Basis geeignet sind.

Virusähnliche Partikel (VLPs) haben eine ähnliche Struktur wie Viren, können jedoch keine Infektionen oder Krankheiten verursachen. Wenn VLPs in den Körper injiziert werden, lösen sie eine Immunantwort aus, die der nach einer Virusinfektion ähnelt. Das bedeutet, dass VLPs als Impfstoffe gegen Viren eingesetzt werden können, die beim Menschen Krankheiten verursachen. Viele Arzneimittel, sogenannte Biologika, werden aus lebenden Zellen hergestellt, darunter auch Zellen, die ursprünglich aus Eierstöcken des Chinesischen Hamsters (CHO-Zellen) gewonnen wurden. Wir haben eine einfache Methode entwickelt, um VLPs ähnlich dem SARS-CoV-2-Virus in CHO-Zellen zu produzieren. Wir zeigen, dass die Impfung von Nagetieren mit diesen VLPs verhindert, dass sie nach einer Infektion mit SARS-CoV-2 erkranken. Diese VLPs könnten Teil eines alternativen, leicht herzustellenden Impfstoffs zur Vorbeugung von COVID-19 beim Menschen werden.

Auf der Suche nach sicheren, wirtschaftlichen und wirksamen Impfstoffen gegen das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) wurde eine Reihe von Strategien zur Antigenproduktion und -abgabe untersucht. In den USA und Kanada basierten die ersten zugelassenen Impfstoffe auf der mRNA- oder adenoviralen Vektor-induzierten Expression des Spike (S)-Antigens durch Wirtszellen1. Gereinigte und mit Adjuvans versehene Antigenimpfstoffe, die aus S-Proteinen (voller Länge oder Fragmenten) wie Nuvaxovid (Novavax) und VidPrevtyn (Sanofi/GSK) oder S-dekorierten VLPs wie Covifenz (Medicago) bestehen können, entwickelten sich langsamer, haben dies aber getan erlangte durch die jüngsten Zulassungen durch die Aufsichtsbehörden an Bedeutung. In dieser Hinsicht hat Novavax NVX-COV2373, das die angestammte S-Sequenz enthält, nach drei Dosen gezeigt, dass es robustere geometrische Mitteltiter (GMT) neutralisierender Antikörper gegen die Omicron BA.1-Sublinie erzeugt als der BNT162b-mRNA-Impfstoff2. Im Vergleich zum ursprünglichen Comirnaty (Pfizer BioNTech) wurde in verschiedenen klinischen Studien gezeigt, dass Auffrischungsdosen von VidPrevtyn die Immunität gegen verschiedene SARS-CoV-2-Varianten mit höherer neutralisierender Aktivität gegen Omicron BA.13 wiederherstellen. VLPs, die S-Protein präsentieren, ähneln strukturell Wildtypviren4 und fördern eine hohe Immunogenität aufgrund ihrer sich wiederholenden Antigenanordnung, die starke Th1/Th2-Reaktionen induziert. Zu den weiteren Vorteilen von VLPs als Impfstoffantigene gehören Lagerstabilität, starke Erkennung und Aufnahme durch periphere Antigen-präsentierende Zellen (APCs); VLPs eliminieren auch das Risiko revertanter Stämme und den potenziellen Verlust wichtiger neutralisierender Epitope, die mit abgeschwächten und inaktivierten Viren verbunden sind5,6,7,8.

VLPs, die S-Antigene aufweisen, werden zunehmend als Kandidaten für die klinische Entwicklung eines SARS-CoV-2-Impfstoffs angesehen. VBI-Impfstoffe haben Phase-I-Studien mit einem Impfstoff auf Basis von VLPs abgeschlossen, die auf dem retroviralen Gag-Kernprotein basieren, das zusammen mit S-Protein9 exprimiert wird, einem gängigen Ansatz zur Induktion der VLP-Bildung in Säugetierzellen. Medicago (Covifenz) erhielt in Kanada die behördliche Zulassung für VLPs, die in N.-benthamiana-Pflanzen durch Expression eines chimären Konstrukts hergestellt werden, das aus der S-Ektodomäne besteht, die mit den Transmembran- und C-terminalen Domänen von Influenza HA10,11 fusioniert ist. VLPs können auch durch Koexpression der Coronavirus-Strukturproteine Membran (M), Hülle (E), Nukleokapsid (N) und S hergestellt werden. Dieser Ansatz führt zu VLPs, die dem natürlichen Virion ähnlicher sind und wird ebenfalls klinisch untersucht Bewertung4,12.

Das Versprechen von VLPs als SARS-CoV-2-Impfstoffantigene wird durch häufige Fallstricke zunichte gemacht, darunter Herausforderungen bei der Herstellbarkeit, schlechte Partikelausbeuten, niedrige S-Proteindichte auf Partikeln und heterologe Expressionsplattform-gesteuerte, nicht-menschliche Glykosylierung. Aus diesen Gründen und aufgrund unseres Erfolgs bei der Expression des S-Proteins in sehr hohen Mengen in Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters (CHO)13,14,15 haben wir untersucht, ob diese Zellen, die vorherrschenden Säugetierzellwirte für die Herstellung therapeutischer Proteine, dies auch sein könnten Wird zur effektiven Herstellung von SARS-CoV-2-VLPs verwendet.

Hier beschreiben wir, wie die Expression des nativen SARS-CoV-2-S-Proteins voller Länge in CHO-Zellen die Freisetzung reichlich vorhandener S-beschichteter VLPs (S-VLP) induziert, ohne dass die Koexpression zusätzlicher viraler Strukturproteine erforderlich ist. Diese S-VLPs können in CHO-Zellen produziert werden, die für die Unterdrückung der Produktion endogener Retrovirus-ähnlicher Partikel (ERVLP) entwickelt wurden, die andernfalls den Impfstoffkandidaten kontaminieren könnten. Eine effektive Reinigung von S-VLPs wurde aus Zellkulturüberständen mithilfe eines einstufigen Affinitätschromatographieprotokolls erreicht. Zur detaillierten Charakterisierung dieser Partikel wurden verschiedene biochemische und biophysikalische Tests durchgeführt, darunter S-Proteinkonzentration, Partikelgröße, S-Oberflächendichte und N-Glykan-Identität. Schließlich haben wir gezeigt, dass gereinigte S-VLPs als Impfantigene in präklinischen Nagetiermodellen sehr wirksam sind und mit zugelassenen Adjuvantien einen wirksamen Schutz bei Dosen im Submikrogrammbereich bieten. Wir glauben, dass diese VLPs aufgrund ihrer guten Herstellbarkeit, Stabilität und Wirksamkeit vielversprechende Antigene für COVID-19-Impfstoffe der nächsten Generation sind.

NRC CHO2353™-Zelllinien wurden bereits beschrieben16,17. CHO2353 ist ein Klon, der aus CHO-DXB11-Zellen stammt, die aufgrund ihrer hohen Produktionsausbeute an rekombinanten Proteinen ausgewählt wurden. Eine vollständige Beschreibung der Herkunft und Auswahl dieses Klons finden Sie in Lit. 15. Der Klon CHO-C2 wurde vom parentalen CHO2353 abgeleitet, indem retrovirale gag- und env-Sequenzen, die für die ERVLP-Bildung und -Freisetzung verantwortlich sind, unter Verwendung der CRISPR-Cas9-Technologie gezielt und zerstört wurden, ähnlich wie in Lit. beschrieben. 18. Die Zellen wurden in einer proprietären Medienformulierung in Polycarbonat-Erlenmeyerkolben mit 0,2-µm-Entlüftungskappe (Corning) unter konstantem Orbitalschütteln bei 120 U/min in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 bei 37 °C gehalten. Alle in dieser Studie verwendeten Zellen waren negativ für Mykoplasmen.

Die kodierenden Sequenzen für SARS-CoV-2 S, M und E wurden aus der Genom-Vorfahrensequenz NC_045512 erhalten. Alle S-Proteinsequenzen enthielten Mutationen an der Furin-Spaltstelle (R682G, R683G, R685S), stabilisierenden Prolinen (K986P, V987P) und dem C-terminalen HA-Epitop-Tag (YPYDVPDYA). Expressionskonstrukte für Spikes wurden durch erneute Synthese und Austausch von Restriktionsfragmenten hergestellt, die Mutationen umfassen, die in Beta B.1.351 (L18F D80A, D215G, L241del, L242del, A243del, R246I, K417N, E484K, N501Y, D614G, A701V), Delta B vorhanden sind. 1.617.2 (T19R, G142D, E156del, F157del, R158G, L452R, T478K, D614G, P681R, D950N) und Omicron B.1.1.529 (A67V, H69del, V70del, T95I, G142D, V143del, Y144del, Y1 45del, N211del, L212I, E215del, E216del, E217del, F339D, S371L, S373P, S375F, K417N, N440K, G446S, S477N, T478K, E484A, Q493K, G496S, Q498R, N501Y, Y505H, T547K, D6 14G, H655Y, N679K, P681H, N764K, D796Y, N856K, Q954H, N969K, L981F) Varianten. Das SmT2v3-Konstrukt besteht aus der Ektodomäne des SARS-CoV-2-Vorfahrenstamms S, fusioniert mit T4-Foldon, und ist identisch mit dem zuvor beschriebenen ECDm-T4-Fib-Konstrukt13, jedoch ohne C-terminale Epitop-Tags. Alle Gensequenzen wurden von GenScript, Piscataway, NJ, USA, synthetisiert und im pTT5®-Plasmid zwischen EcoRI- und BamHI-Restriktionsstellen subkloniert. Plasmide wurden in E. coli DH5α-Bakterien (Invitrogen) transformiert und in CircleGrow-Medium (MP Biomedicals), ergänzt mit 100 µg/ml Ampicillin (Gibco), amplifiziert. Plasmide wurden mithilfe einer proprietären Anionenaustauschchromatographie-Methode gereinigt, gefolgt von Isopropanol-Fällung, Ethanolwäsche und 0,22-µm-Filtration. Die DNA-Quantifizierung wurde mit einem DeNovix DS-11+ Spektrophotometer durchgeführt. Die Sequenzen wurden durch Sanger-Sequenzierung unter Verwendung eines genetischen Analysegeräts ABI 3500xl verifiziert.

CHO-Zelltransfektionsmethoden wurden wie in Lit. beschrieben durchgeführt. 13. Einzelne strukturelle SARS-CoV-2-Gentransfektionen wurden in CHO-Medien mit 85 % (w:w) pTT5-Spike-HA, 10 % Bcl-XL-Plasmid (anti-apoptotischer Effektor) und 5 % GFP-Plasmid durchgeführt. Die Co-Transfektion struktureller SARS-CoV-2-Gene wurde unter Verwendung einer Mischung von Plasmiden durchgeführt, die 42,5 % pTT5-Membranhülle (ME), 42,5 % pTT5-Spike-HA, 10 % Bcl-XL und 5 % GFP, verdünnt in CHO, umfasste komplette Medien.

Fünf Tage nach der Transfektion wurden Zellsuspensionen (Lebensfähigkeit ≥ 95 %) 15 Minuten lang bei 3200 U/min auf einer Sorvall Legend RT-Zentrifuge (Thermo Fisher Scientific) zentrifugiert. Zellüberstände wurden dann mit 10 U/ml Denarase (C-LEcta) und 5 mM MgCl2 behandelt und 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Zur VLP-Sedimentation wurden die behandelten Überstände über einem 15 % Optiprep (Gew./Vol.) (Sigma-Aldrich)19-Kissen (10 % des Gesamtvolumens) bei 5300 × g 16 Stunden lang bei 4 °C zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurden die Überstände verworfen und die Pellets in DPBS (Cytiva) resuspendiert.

Mit Denarase behandelte CHO-C2-Überstände wurden direkt auf AVIPure-COV2S VLP (AVIpure)-Harz (Avitide) gereinigt, das in eine BioRad PolyPrep-Chromatographiesäule gepackt war. Die AVIpure-Säule wurde zunächst mit 5 Säulenvolumina (CV) DPBS äquilibriert. Als nächstes wurde der behandelte Überstand mit einer konstanten Flussrate von 1 ml/min geladen. Die Säule wurde dann mit 5 CVs DPBS gewaschen. VLP wurde mit 50 mM Bis-Tris, 1 M MgCl2, pH 6,0, eluiert, gefolgt von der Entsalzung in DPBS unter Verwendung von NAP25-Säulen. Entsalzte VLPs wurden filtersterilisiert und vor In-vivo-Experimenten auf Endotoxine getestet (Endosafe-PTS-Kartuschen, Charles River). Die SmT2v3-lösliche S-Ektodomäne wurde aus stabilen CHO-Zellen wie zuvor beschrieben hergestellt14 und unter Verwendung des NGL COVID-19 S-Affinitätsharzes (Repligen) gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt.

Sedimentierte oder gereinigte VLPs wurden mit RIPA-Puffer (150 mM NaCl, 1 % NP-40, 0,5 % Natriumdesoxycholat, 0,1 % SDS, 50 mM Tris-HCl pH 7,4) lysiert, ergänzt mit einem Protease-Inhibitor-Cocktail (cOmplete, EDTA-frei, Roche). ). VLP-Proben in RIPA-Puffer wurden 20 Minuten bei 4 °C inkubiert, gefolgt von einer 15-minütigen Zentrifugation bei Höchstgeschwindigkeit in einer Tischzentrifuge (Eppendorf 5427R). Die Pellets wurden verworfen und die Überstände wurden gewonnen. Die Proteinquantifizierung wurde mit dem Pierce-Bicinchoninsäure (BCA)-Proteinassay (Thermo Fisher Scientific) durchgeführt. Kurz gesagt, 200 µL BCA-Arbeitsreagenz, hergestellt gemäß dem Protokoll des Herstellers, wurden zu einer 96-Well-Platte gegeben und mit 25 µL Rinderserumalbumin (BSA)-Standards (Thermo Fischer Scientific), sedimentierten oder gereinigten VLP-Lysaten gemischt und inkubiert 30 Min. bei 37 °C. Die Absorption bei 562 nm wurde mit einem SpectraMax 340PC-Spektrophotometer gemessen.

Nach der Proteinquantifizierung wurden 0,7 µg Gesamtprotein aus VLPs oder 7,5 µL Denarase-behandelte Überstände (sofern nicht anders angegeben) mit XT-Probenpuffer 4X (Bio-Rad), ergänzt mit 200 mM, gemischt (3:1 [v:v]). Dithiothreitol (DTT), 10 Minuten lang unter reduzierenden Bedingungen bei 70 °C hitzedenaturiert, gefolgt von der Trennung der Proteine durch SDS-PAGE unter Verwendung von NuPAGE 4–12 % Bis-Tris-Gelen. Die Gesamtproteinfärbung (Coomassie Blue) wurde mit Standardmethoden durchgeführt. Die VLP-S-Proteinkonzentration wurde durch Vergleich mit einem löslichen S-Trimer-Standard (STD)-Referenzmaterial SMT1-120 von NRC Metrology unter Verwendung eines ChemiDoc MP-Bildgebungssystems (Bio-Rad) und der Image Lab 6.1-Software bestimmt.

Für das Immunblotting wurden durch SDS-PAGE aufgetrennte Proteine mit einem Trans-Blot Turbo (Bio-Rad)-Gerät mit Standardeinstellungen auf Nitrozellulosemembranen übertragen. Die Membranen wurden 30 Minuten lang mit 5 % Milch in DPBS mit 0,1 % Tween 20 (DPBS-T) blockiert, gefolgt von drei 5-minütigen Wäschen mit DPBS-T. Die Membranen wurden dann 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit Anti-S (S1) (ProSci Nr. 9083), Anti-Membran (ProSci Nr. 3529) oder einem Maus-Anti-ERVLP-Gag p30 (hausintern hergestellt) bei 1 inkubiert :1000 Verdünnung. Auf die Primärantikörper-Inkubation folgten drei 5-minütige Waschungen mit DPBS-T und eine einstündige Inkubation mit Meerrettich-Peroxidase-konjugierten Sekundärantikörpern in einer Verdünnung von 1/10.000 für Ziegen-Anti-Kaninchen (Jackson 111-035-003) und 1/5.000 Verdünnung für Ziegen-Anti-Maus (Sigma A2304). Nach drei weiteren 5-minütigen Wäschen mit DPBS-T wurden die Banden mit Clarity Western ECL Substrate (Bio-Rad) und dem ChemiDoc MP-Bildgebungssystem sichtbar gemacht. Alle nicht zugeschnittenen Gel-/Blot-Bilder können in der ergänzenden Abbildung 5 eingesehen werden.

Die ELISA-Methode zum Nachweis der S-VLP-Bindung an hACE2 wird im Abschnitt „Ergänzende Methoden“ bereitgestellt.

Die CHO-HCP-Quantifizierung wurde durch ELISA unter Verwendung des CHO Cygnus-Kits (Kat.-Nr. F550-1) gemäß dem Protokoll des Herstellers bestimmt.

Die Beobachtung von VLPs mit einem Transmissionselektronenmikroskop (TEM, HITACHI H-7500 und HITACHI HT7700 120), das mit einer unten montierten AMT NanoSprint 12MP-Kamera ausgestattet war und bei 80 kV im Hochkontrastmodus arbeitete, wurde unter Verwendung einer Negativfärbung durchgeführt. TEM-Gitter (Cu 200 Mesh, 15–25 nm Kohlenstoff unterstützt) wurden mit EMS GloQube-D, einem Zweikammer-Glimmentladungssystem (Electron Microscopy Sciences), im negativen Modus mit einem Plasmastrom von 25 mA während 45 s frisch glimmentladen. Solche Gitter wurden 5 Minuten lang auf 10-µL-Probenaliquots auf Parafilm geschwommen. Die überschüssigen Tröpfchen wurden anschließend mit Filterpapierstreifen (Whatman 541) vom Rand des Gitters abgesaugt. Das Gitter wurde dann dreimal mit drei Tropfen doppelt destilliertem Wasser gespült, wobei jedes Mal der Überschuss entfernt wurde. Unmittelbar nach der letzten Spülung wurde das Gitter 60 s lang der Färbelösung (1 % Uranylformiat) ausgesetzt und der Fleck vorsichtig mit einem frischen Stück Filterpapier entfernt. Abschließend wurde das Gitter 2 Stunden lang bei Raumtemperatur getrocknet und für die TEM-Analyse verwendet.

S-VLP-Proben wurden durch Kryo-Eintauchen21 mit einem Leica-EM GP2-Kolben hergestellt. TEM-Gitter (Cu 400 Mesh, mit löchrigem Kohlenstofffilm) wurden 60 s lang mit einem Harrick PDC-32G Plasmareiniger mit einer Plasmaleistung von 18 W behandelt. Solche Gitter wurden mit einer am Adapter befestigten Pinzette aufgenommen und in eine Klimakammer (Luftfeuchtigkeit ~ 80 %) des Leica-EM GP2-Geräts geladen. 5 µL der wässrigen Probe wurden auf die Kohlenstofffilmseite des TEM-Gitters aufgetragen und 1,5 s lang mit einem Filterpapier (Whatman Nr. 1) abgetupft. Das Gitter wurde dann in flüssiges Ethan mit einer Temperatur von −180 °C getaucht und in eine Kryo-Probenbox in flüssigem Stickstoff (LN2) überführt. Die Probenbox wurde weiter in LN2 überführt und in einen vorgekühlten (–180 °C) Gatan 914-Kryoprobenhalter in einer mit LN2 gefüllten Workstation geladen. Der Halter mit dem unter einer Frostschutzabdeckung geschützten Kryogitter wurde in die TEM-Säule eingesetzt. Die Beobachtung der kryoeingetauchten VLP-Probe wurde mit einem JEOL 2200 FS TEM durchgeführt, das bei 200 kV arbeitet und mit einem Feldemissionsfilament ausgestattet ist. Die Bildsammlungen erfolgten im Niedrigdosismodus22, um Strahlenschäden zu mildern. Zur Verbesserung des Bildkontrasts wurde ein 10 eV breiter Energiefilter (bei dem nur Elektronen ohne Energieverlust zur Bilderzeugung beitragen) verwendet. Jedes Bild wurde mit einer Belichtungszeit zwischen 0,5 und 1 s aufgenommen, basierend auf der lokalen Glaskörpereisdicke und den Mikroskopeinstellungen. Die Bilder wurden mit den integrierten Funktionen (Glättung, Kontrastumkehr) der Gatan DigitalMicrograph-Software verarbeitet.

Die Quantifizierung des S-Proteins an der VLP-Oberfläche und die Modellierungsmethode werden im Abschnitt „Ergänzende Methoden“ beschrieben.

S-VLPs-gereinigtes Material und in DPBS enthaltene Scheinproben wurden von NTA mit einem NanoSight NS 5000 (Malvern Panalytical) analysiert, der mit einer Laserwellenlänge von 532 nm und einem 565-nm-Langpassfilter ausgestattet war. Es wurden zwei Datensätze erfasst. Parameter für NTA-Messungen von Proben wurden wie folgt durchgeführt: VLPs und Polystyrolkügelchen wurden dreimal (1 unabhängige Präparation) bei einer Temperatur von 20 °C mit der Kamerastufe 16 (Slider Shutter 1300; Slider Gain 512) erfasst. Zur Verarbeitung der erfassten Daten wurden die folgenden Analyseeinstellungen verwendet; Erkennungsschwelle 3; Unschärfegröße und maximale Sprungentfernung waren „Auto“. VLP-Proben wurden in DPBS auf ein minimales Endvolumen von 1 ml verdünnt, um eine Wiederholungsinjektion zu ermöglichen. Das Ansaugen der Probe in das System erfolgte mithilfe der integrierten peristaltischen Pumpe, die mit dem Schlauch verbunden war. Für jede Probe wurde ein Mindestvolumen von 1,8 ml vorbereitet, um eine technische Wiederholungsanalyse zu ermöglichen. Die NanoSight NS 5000-Kalibrierung wurde durch Laden von 100 nm großen Polystyrolkügelchen, 1/100.000 (Thermo Fisher Scientific), mit einem vorgegebenen Akzeptanzkriterium von 15–90 Partikeln pro Bild und einem CV von ≤ 15 % zwischen Injektionen aus demselben Präparat durchgeführt.

Scheinproben wurden in DPBS im Verhältnis 1:475 verdünnt. S-VLPs wurden im Verhältnis 1:500, 1:1000, 1:1250, 1:1500 und 1:2000 verdünnt. Bildverarbeitung, Partikelgrößenverteilung und Konzentrationsberechnungen wurden mit der NanoSight NTA 3.2 Analytical Software (Malvern Panalytical) mit einem Anpassungsmodell mit endlicher Spurlängenanpassung (FTLA) durchgeführt.

Die S-Protein-Glykosylierungsanalysemethode für S-VLPs oder S-Protein wird im Abschnitt „Ergänzende Methoden“ ausführlich beschrieben.

Weibliche C57BL/6-Mäuse (6–8 Wochen alt) und Syrische Goldhamster (81–90 g) wurden von Charles River Laboratories (Saint-Constant, Kanada) gekauft. Die Tiere wurden in der Tierhaltung des National Research Council Canada (NRC) gemäß den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care gehalten. Alle in dieser Studie an Tieren durchgeführten Verfahren wurden von unserem Institutional Review Board (NRC Human Health Therapeutics Animal Care Committee) genehmigt und fallen unter die Tiernutzungsprotokolle 2020.06 und 2020.10. Alle Experimente wurden gemäß den ARRIVE-Richtlinien durchgeführt. Die Erkenntnisse im vorliegenden Manuskript gelten nicht für ein bestimmtes Geschlecht, weibliche Nagetiere wurden jedoch bevorzugt, da sie bei Manipulationen tendenziell weniger aggressiv sind und sich untereinander besser sozialisieren.

Acht Gruppen (n = 10 pro Gruppe) von Mäusen und vier Gruppen (n = 6 pro Gruppe) von Hamstern wurden mit unterschiedlichen Formulierungen immunisiert, um die Immunogenität von S-VLPs zu bewerten. Kurz gesagt, affinitätsgereinigte S-VLPs und adjuvante Impfstoffkomponenten wurden vor der Verabreichung in einem Endvolumen von 50 µL pro Dosis in PBS (Thermo Fisher Scientific) gemischt und verdünnt. Die Dosierungen von Adju-phos (Invivogen) basierten auf Daten aus früheren Studien mit 50 µg Al3+ pro Dosis23. AS01b (GlaxoSmithKline, Brentford, UK) basierend auf dem Saponin QS-21 und dem TLR4-Agonisten Monophosphoryl Lipid A (MPL) wurde in einer Menge von 1/20 der menschlichen Dosis verwendet.

Die Tiere wurden durch intramuskuläre (im) Injektion (50 µL) in den linken Tibialis anterior (TA)-Muskel an den Tagen 0 und 21 immunisiert. Impfstoffformulierungen von 3 µg S-VLPs allein oder 3, 0,3 und 0,06 µg adjuvantiertes S -VLPs wurden Mäusen verabreicht. Impfstoffformulierungen für Hamsterstudien bestanden aus: PBS-Vehikel (naiv), 0,3 µg S-VLPs, AS01b allein und 0,3 µg S-VLPs+AS01b. Die S-VLP-Mengen basieren auf der Menge des in den gereinigten Partikeln vorhandenen S-Proteins und die Adjuvansmengen wurden unabhängig von der Antigendosis konstant gehalten. Am 28. Tag wurden die Mäuse mit Isofluran anästhesiert und dann durch Zervixluxation eingeschläfert, bevor die Milz zur Messung der zellulären Immunantworten mittels IFN-γ ELISpot entnommen wurde. Den Mäusen wurde an den Tagen 20 und 28 Blut über die Vena submandibularis mit gewonnenem Serum entnommen, das zur Quantifizierung der Antigen-spezifischen IgG-Antikörperspiegel und Neutralisierungstests verwendet wurde. Am 35. Tag wurden Hamster intranasal mit 1 × 105 PFU des SARS-CoV-2-Vorfahrenstamms (Kanada/ON/VIDO-01/2020, erhalten vom National Microbiology Lab, Winnipeg, Kanada) herausgefordert und auf Körpergewichtsveränderungen überwacht nächsten fünf aufeinanderfolgenden Tagen. Am 40. Tag wurden die Tiere durch Einwirkung von CO2 eingeschläfert (nach Anästhesie mit Isofuran) und Lungengewebe wurde zur Beurteilung der Viruslast mittels Plaque-Assay und viraler RNA-Detektion und -Quantifizierung mittels RT-qPCR entnommen.

Die Methode zur Bestimmung der gesamten Anti-S-IgGs wurde bereits beschrieben23 und kann im Abschnitt „Ergänzende Methoden“ ausführlich nachgelesen werden.

Der Ersatzneutralisationstest wurde wie in Lit. durchgeführt. 24 und wird im Abschnitt „Ergänzende Methoden“ beschrieben.

Virale RNA (vRNA) wurde aus Lungengewebe isoliert, das in 1 ml RNA/DNA Shield (Zymo Research) homogenisiert war. vRNA wurde unter BSL-3-Bedingungen mit dem Quick-RNA Viral Kit (Zymo Research) extrahiert. Die virale genomische RNA wurde durch Echtzeit-PCR für das virale Ziel-Hüllgen wie zuvor beschrieben quantifiziert25.

Dieser Test wurde in Einrichtungen der Eindämmungsstufe 3 (CL3) wie zuvor beschrieben23 durchgeführt. Kurz gesagt, die gesamten linken Lungen jedes Hamsters wurden einzeln in 1 ml PBS homogenisiert und zentrifugiert. Die geklärten Überstände wurden dann 1 zu 10 Reihenverdünnungen in Infektionsmedien (1 × DMEM, Medien mit hohem Glucosegehalt, ergänzt mit 1 × nicht-essentieller Aminosäure, 100 U/ml Penicillin-Streptomycin, 1 mM Natriumpyruvat und 0,1 % Rinderserum) verdünnt Albumin). Als nächstes wurden Vero E6-Zellen 1 Stunde lang bei 37 °C infiziert, bevor das Inokulum entfernt und Overlay-Medium hinzugefügt wurde, das aus Infektionsmedium mit 0,6 % hochreiner Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt bestand. Infizierte Zellen wurden 72 Stunden lang bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert. Nach der Inkubationszeit wurden die Zellen mit 10 % Formaldehyd fixiert und mit Kristallviolett angefärbt. Die Plaques wurden gezählt und der PFU pro Gramm Lungengewebe bestimmt.

Alle Grafiken und statistischen Analysen in den in diesem Manuskript dargestellten Abbildungen wurden mit GraphPad Prism 9.3.1 (GraphPad-Software) durchgeführt. Acht Gruppen (n = 10 pro Gruppe) von Mäusen und vier Gruppen (n = 6 pro Gruppe) von Hamstern wurden für In-vivo-Experimente untersucht. Eine einfaktorielle ANOVA mit mehreren Vergleichstests von Tukey wurde durchgeführt, um die Bedeutung des gesamten Anti-S-IgG und die Quantifizierung von Spike-spezifischen T-Zell-Analysen zu bewerten. Eine einfaktorielle ANOVA mit mehreren Vergleichstests von Dunnette wurde durchgeführt, um die Bedeutung zellbasierter Ersatzneutralisationstests, der Virusquantifizierung durch Plaque-Assay und der viralen RNA-Quantifizierung in Hamsterlungen zu bewerten. p ≤ 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Angesichts der Vorteile und der weit verbreiteten Verwendung von CHO-Zellen für die Herstellung therapeutischer Proteine26 untersuchten wir zunächst ihr Potenzial zur Produktion von VLPs durch Kotransfektion der SARS-CoV-2-Strukturproteine S, M und E (ergänzende Abbildung 1a). Es wurde berichtet, dass dies die minimalen viralen Komponenten sind, die bei gleichzeitiger Expression die Bildung von VLPs ermöglichen27,28. 5 Tage nach der Transfektion beobachteten wir mittels SDS-PAGE (Gesamtproteinfärbung und Western Blot, Abb. 1a) das Vorhandensein von M- und S-Proteinen in sedimentierbaren Partikeln aus Zellüberständen. Bei der Negativ-Stain-Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)-Bildgebung wurden jedoch nur wenige umhüllte Partikel festgestellt, und die beobachteten Partikel enthielten keine klar definierte Korona, ein Merkmal von Coronaviren, da die Dichte der hervorstehenden S-Proteine recht gering war (Abb. 1b). .

a Sedimentierte Überstände mit 15 % Iodixanol-Kissen aus CHO2353-Zellen, transfiziert mit S- oder ME/S-Plasmiden. Links Gesamtproteinfärbung (Coomassie-Blau) von S oder ME/S. Rechts: Immunoblot mit Anti-Spike (S1) zum Nachweis von S (~180 kDa). Das SARS-CoV-2-Membranprotein (M) wird mit Anti-M bei ~17 kDa nachgewiesen. b Repräsentatives TEM-Bild sedimentierter ME/S-VLPs. Weiße Pfeile weisen auf potenzielle VLPs hin. Unten im Bild wird ein Maßstabsbalken von 100 nm angezeigt. c Repräsentatives TEM-Bild sedimentierter VLPs, die durch die Expression von S-Protein (S-VLPs) erzeugt werden. Unten im Bild wird ein Maßstabsbalken von 200 nm angezeigt. Weiße Pfeile zeigen VLPs an. d Repräsentativer Immunoblot verschiedener S-VLPs-Varianten, nachgewiesen mit Anti-S1. Von links nach rechts: Mock-, Beta- (B.1.351), Delta- (B.1.617.2) und Omicron- (B.1.1.529) S-VLPs. e Repräsentative TEM-Bilder sedimentierter S-VLPs-Varianten. Von links nach rechts: Beta (B.1.351), Delta (B.1.617.2) und Omicron (B.1.1.529). Unten in jedem Bild wird ein 50-nm-Maßstabsbalken angezeigt.

Bemerkenswerterweise wurden bei alleiniger Expression von S wesentlich höhere Mengen dieses Proteins in CHO-Zellüberständen nachgewiesen, obwohl eine intakte Transmembrandomäne vorhanden war, die seine Sekretion als lösliches Protein verhindern sollte. S-Protein konnte auch durch Ultrazentrifugation auf einem Iodixanol-Kissen sedimentiert werden (Abb. 1a), was darauf hindeutet, dass S allein die Bildung von VLPs auslöste. Bemerkenswerterweise beobachteten wir mittels TEM das Vorhandensein einer großen Menge im Allgemeinen kugelförmiger VLPs, die von einer wohldefinierten Korona umgeben sind, die aus einer dichten Hülle aus S-Protein besteht (Abb. 1c). Die Fähigkeit, mit diesem Ansatz VLPs zu bilden, war nicht auf die angestammte S-Sequenz beschränkt: Auch die Transfektion von CHO-Zellen mit Expressionsplasmidkonstrukten, die S-Proteine aus Beta-, Delta- und Omicron-Varianten kodieren, erzeugte VLPs. Bei der Expression dieser Konstrukte konnten wir das Vorhandensein von S-Proteinen in mit Iodixanol sedimentierten Proben mittels Western Blot nachweisen (Abb. 1d) und die Bildung von VLPs aus verschiedenen SARS-CoV-2 S-Varianten mittels TEM bestätigen (Abb. 1e). Letzteres zeigt, dass dieser Ansatz auf verschiedene S-Variantensequenzen angewendet werden kann. Die restlichen Experimente, einschließlich Reinigung, Charakterisierung und In-vivo-Tests, wurden mit VLPs durchgeführt, die S des Vorfahrenstamms zeigten. Nach unserem besten Wissen ist dies der erste Bericht, der die Produktion von SARS-CoV-2-VLPs aus Säugetierzellen durch Überexpression des nativen S-Proteins ohne andere virale Komponenten beschreibt.

Die Freisetzung von ERVLPs durch CHO-Zellen29,30 könnte ein Problem für die Herstellung rekombinanter umhüllter VLP-Impfstoffe darstellen, insbesondere aufgrund der wahrscheinlichen strukturellen und biophysikalischen Ähnlichkeit von rekombinanten umhüllten VLPs und endogenen CHO-ERVLPs, die die Trennung der beiden Einheiten im Downstream-Prozess schwierig machen würde Verarbeitungsschritte. CRISPR-Cas9 wurde verwendet, um Retrovirus-ähnliche provirale Elemente wie gag und env im CHO-Genom anzugreifen18, und wir nutzten diesen Ansatz auf ähnliche Weise, um eine CHO-Zelllinie, CHO-C2, mit gestörter ERVLP-Produktion zu entwickeln. Wie in Abb. 2a gezeigt, liefert CHO-C2 S-VLP-Ausbeuten, die denen von nicht gentechnisch veränderten Zellen ähneln, jedoch ohne das Vorhandensein von ERVLPs, wie durch Gag-Western-Blotting angezeigt (Gag ist die Hauptproteinkomponente, die für die Bildung und Knospung dieser Partikel verantwortlich ist). 18. Die volumetrische Produktivität für S-VLPs, die in CHO-C2-Zellen (geerntet 5 Tage nach der Transfektion) produziert wurden, betrug durchschnittlich 8,5 ± 0,4 mg/L (Standardfehler des Mittelwerts [SEM]; n = 6), basierend auf dem S-Proteingehalt von Iodixanol -sedimentierte Partikel (Abb. 2b). In der Literatur, die andere Methoden zur Herstellung von VLPs mit SARS-CoV-2 S beschreibt, werden volumetrische Titer des S-Proteins in ungereinigten Überständen selten angegeben. In einem Bericht wurde geschätzt, dass der Gag-basierte VLP-Überstand von HEK293-Zellen 1,78 mg/L S-Protein enthielt31. Es ist bemerkenswert, dass der nachgeschaltete Reinigungsprozess für Gag-S-VLPs die S-Konzentrationen drastisch reduzieren kann31.

a CHO-C2 (ERVLP-KO)-Zellen. Links zeigt die Gesamtproteinfärbung (Coomassie-Blau) Überstände (7,5 µL) und sedimentierte (0,35 µg Gesamtprotein) VLPs, die in CHO2353 (parental) oder CHO-C2 hergestellt wurden. Rechts: Western Blot von VLPs, die von CHO2353 oder CHO-C2 produziert wurden. Der obere Teil des Blots zeigt das durch Anti-Spike (S1) in geklärter Ernte oder sedimentierten VLPs nachgewiesene S-Protein voller Länge. Der untere Blot ist mit Anti-Gag p30 gefärbt und zeigt die Abwesenheit von Gag in von CHO-C2 abgeleiteten VLPs. b Streudiagramm des gesamten S-Proteins (mg/L) aus verschiedenen Proben am 5. Tag der Transfektion. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM von sechs unabhängigen Proben dargestellt. c Vergleich der Gesamtproteinfärbung von sedimentierten und affinitätsgereinigten S-VLPs. Auf der linken Seite wurde 1 µg rekombinantes, lösliches S-Protein (S STD) geladen. Für VLPs wurden 0,7 µg Gesamtprotein pro Vertiefung geladen. d Repräsentatives TEM-Bild von affinitätsgereinigten S-VLPs. Unten wird ein 200-nm-Skalenbalken angezeigt. e Repräsentatives hochauflösendes TEM-Bild einzelner affinitätsgereinigter S-VLPs, aufgenommen mit einem HITACHI HT7700 120. Unten wird ein 50-nm-Maßstabsbalken angezeigt. f Streudiagramm des gesamten S-Proteins (mg/L) aus verschiedenen gereinigten Proben am 5. Tag der Transfektion. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM von vier unabhängigen Proben dargestellt. g ELISA-Assay. Dosis-Wirkungs-Kurve von gereinigtem S-VLP (Ausgangskonzentration [S] = 0,081 mg/ml) mit 11 Verdünnungsreihen. Rote Punkte stellen S-VLPs auf einer hACE2-beschichteten Platte in einer S-förmigen Sigmoidkurve in Rot dar. Blaue Punkte stellen S-VLPs auf einer unbeschichteten (Schein-)Platte dar, die durch eine blaue Linie verbunden sind.

Es ist im Allgemeinen eine Herausforderung, Reinigungsschemata zu entwickeln, um rekombinante umhüllte VLPs von ERVLPs und anderen extrazellulären Vesikeln zu trennen, die spontan aus Wirtszellen freigesetzt werden. Für die S-VLP-Reinigung haben wir mehrere herkömmliche Säulenchromatographieharze mit unbefriedigenden Ergebnissen getestet, bevor wir mit der Bewertung der Affinitätschromatographieoptionen fortfuhren, darunter kommerzielle S-Affinitätsharze (z. B. Repligen oder Avitide) und hausinterne Zubereitungen von an S-Antikörpern konjugierten oder rekombinanten Perlen menschliches ACE2 (hACE2). Alle getesteten Harze banden VLPs effektiv, ihre Elution unter nicht denaturierenden Bedingungen war jedoch recht ineffizient. Um dieses Problem anzugehen, wurde von Avitide (AVIPure COV2S VLP) ein S-Affinitätsharz mit geringerer Ligandendichte erzeugt. Dieses Harz ermöglicht eine effektive Erfassung und sanfte Elution von S-VLPs, die dann für In-vivo-Tests gepuffert und durch 0,2-µm-Filtration sterilisiert werden könnten. Im Vergleich zu mit Iodixanol sedimentierten Proben enthalten die affinitätsgereinigten S-VLPs durch Gesamtproteinfärbung sichtbar geringere Mengen an Nicht-S-Proteinen und zeigen durch TEM eine hohe Partikelkonzentration mit erhaltener Morphologie (Abb. 2c – e). Um zu bewerten, ob das S-Protein auf der VLP-Oberfläche in der Lage ist, seinen Rezeptor hACE2 durch die Freilegung der Rezeptorbindungsdomäne (RBD) zu binden, führten wir einen Sandwich-ELISA-Assay durch, der auf dem Einfangen von VLPs durch rekombinantes hACE2 und anschließendem Nachweis mit Anti-Virus basiert -Spike-Antikörper. Wie in Abb. 2g gezeigt, binden S-VLPs an hACE2-beschichtete Platten, nicht jedoch an unbeschichtete Kontrollplatten.

Unter Verwendung eines ELISA-Kits für CHO-Wirtszellprotein (HCP) als orthogonalen Assay zur Beurteilung der Reinheit haben wir festgestellt, dass einstufige affinitätsgereinigte VLP-Präparate etwa 47 × 103 ppm HCPs (bezogen auf das Gesamtprotein) enthalten (Tabelle 1). Bei einer prospektiven klinischen Dosis von 3,75 µg S-Protein (basierend auf dem Covifenz SARS-CoV-2 VLP-Impfstoff10) würde dies 0,17 µg HCPs in S-VLPs entsprechen. Im Vergleich dazu wurde berichtet, dass der ChAdOx1 nCov19-Impfstoff (AstraZeneca) wesentlich mehr HCPs pro Dosis enthält32. Unsere auf CHO-C2 basierende Produktionsmethode, gefolgt von einer einstufigen Affinitätsreinigung, ergab 2,4 ± 0,3 mg/L (SEM) VLPs basierend auf dem S-Proteingehalt (Abb. 2g). Bemerkenswert ist, dass andere VLP-Plattformen, die auf der Koexpression von Gag mit S basieren, um die VLP-Bildung voranzutreiben, gereinigte Verhältnisse von S zu Gag liefern, die sehr niedrig sind (z. B. von VBI beschriebene gereinigte VLPs, die höchstens 2,78 % S-Protein im Vergleich zu Gag9 enthalten). mit viel geringeren Gesamtmengen an S-Protein (0,015 mg S in VLPs, gereinigt aus einem Liter HEK293-Überstand9,31). In solchen Fällen ist Gag das mit Abstand am häufigsten vorkommende Protein im gereinigten VLP-Endprodukt (im Vergleich zu S-VLPs, die zu >80 % aus S-Protein bestehen); Obwohl in mehreren Studien gezeigt wurde, dass Gag-S-basierte VLPs wirksame Immunogene sind, glauben wir, dass die höhere S-Dichte und die geringeren Mengen an nicht relevanten Strukturproteinen ein wahrscheinlicher Vorteil unserer VLP-Plattform sind.

Wir haben auch die Menge und Größe der VLPs durch Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) ermittelt und die Stabilität während der Lagerung bei 4 °C bewertet. Aus einer 1-L-Kultur gereinigte S-VLPs enthielten 1,38 × 1013 Partikel mit einer mittleren Breite von 119–128 nm. Im Vergleich dazu ergaben gereinigte SARS-CoV-2-VLPs, die in Insektenzellen durch die Expression von M + E + S- oder Gag-S-VLPs aus HEK293-Zellen erzeugt wurden, bis zu 5,8 × 1011 bzw. 6,03 × 1010 Partikel pro 1 L Kultur31,33 . Bemerkenswert ist, dass die S-VLP-Partikelkonzentrationen während der Lagerung für mindestens 100 Tage bei 4 ° C konstant blieben, was auf eine sehr gute Lagerstabilität hinweist (Tabelle 2, ergänzende Abbildung 2).

Die Immunisierung durch intramuskuläre (im) Injektion begünstigt die schnelle Erkennung und Aufnahme von Impfantigenen durch periphere APCs34. In dieser Hinsicht kann die Antigendichte auf der Oberfläche des Krankheitserregers oder Partikels zusammen mit seinem Glykosylierungsmuster die Immunogenität und damit die resultierende Immunantwort beeinflussen5,35. Eine TEM-Bildgebung mit negativer Färbung weist darauf hin, dass S-VLPs mehr S auf ihrer Oberfläche enthalten (Abb. 2e) als SARS-CoV-2-Virionen, die in Vero-E6-Zellen produziert werden36,37. Um dies weiter zu untersuchen, haben wir Partikel mittels Kryo-EM sichtbar gemacht. Periphere S-Proteintrimere auf VLPs erinnern an die Präfusionskonfiguration mit durchschnittlichen Längen von ~20 nm (Abb. 3a), ähnlich denen, die in früheren Studien beschrieben wurden . Die hohe Auflösung der Kryo-EM-Bilder ermöglichte es uns, S-Proteintrimere in Umfangsrichtung auf einer großen Anzahl von VLPs mit Kerndurchmessern zwischen 40 und 70 nm zu zählen und eine Korrelationsfunktion zu erstellen, die die S-Zahl mit dem VLP-Kerndurchmesser in Beziehung setzt (ergänzende Abbildung 3a). Mit einer starken Korrelation zwischen Anzahl und Durchmesserverhältnis zwischen Partikeln (R2 = 0,92) berechneten wir dann den tatsächlichen euklidischen Abstand, der äquidistante Punkte zwischen den Spitzen erzeugte (Abb. 3b). Dies ermöglichte die dreidimensionale Modellierung von S-VLPs mit MATLAB, um die Gesamtzahl der Spitzen für ein VLP einer bestimmten Größe abzuschätzen (z. B. enthält ein VLP mit einem Durchmesser von 70 nm 86 Spitzen), wie in Abb. 3c dargestellt. Basierend auf diesem Modell können wir bestätigen, dass CHO-produzierte S-VLPs insgesamt einen höheren S-Gehalt enthalten als der Durchschnitt für intakte SARS-CoV-2-Virionen (25 ± 12 Spitzen)36,37.

Ein individuelles S-VLP-Bild (positiver Kontrast) wurde mittels Kryo-EM aufgenommen. Das abgebildete VLP enthält 20 periphere S-Proteine. Auf dem vergrößerten Bild sind einzelne S-Proteine zu erkennen, die mit einer durchschnittlichen Größe von 20 nm aus der Hülle herausragen. Am unteren Rand jedes Bildes wird eine 25-nm-Maßstabsleiste angezeigt. b Schematische Darstellung des Berechnungsablaufs von der gemessenen Bogenlänge zwischen zwei peripheren Spitzen bis zum tatsächlichen euklidischen Abstand zwischen Spitzen auf der VLP-Kernoberfläche. c Rekonstruktion der S-Verteilung auf VLPs unter Verwendung der realen euklidischen Distanz. VLP-Modelle entsprechen Kerndurchmessern von 40 nm/35 Spitzen, 50 nm/50 Spitzen, 60 nm/67 Spitzen und 70 nm/86 Spitzen. d Zusammensetzungsglycan-Identifizierung des S-VLP und der rekombinanten löslichen (SmT2v3) S-Proteine. Die Identität und der Anteil von 20/22 N-Glykanen wurden mittels LC-MS bestimmt und in Kreisdiagrammen dargestellt. Siehe auch ergänzende Abbildung 3 und ergänzende Datendatei.

Die Fähigkeit von CHO-Zellen, Glykoproteine mit menschenähnlicher Glykosylierung bereitzustellen, könnte für Impfstoff-Antigenkandidaten im Vergleich zu denen, die in Nicht-Säugetier-Zellwirten (z. B. Pflanzen, Hefe oder Insektenzellen) produziert werden, von Vorteil sein38. Die Glykanzusammensetzung beeinflusst möglicherweise nicht unbedingt die Struktur des S-Proteins oder die Rezeptorbindung, könnte aber seine thermische Stabilität oder Wirksamkeit drastisch verändern, um neutralisierende Antikörper zu erzeugen39. Wichtig ist, dass nicht stabilisierte S-Proteine (ähnlich denen, die von ChAdOx1 nCoV19 exprimiert werden) im Vergleich zu stabilisierten rekombinanten trimeren S und S von SARS-CoV-2-Virionen, die alle aus menschlichen Zellen stammen, andere Glykosylierungsmuster zeigten, was auch die Antigenität und andere Faktoren beeinflussen könnte biologische Eigenschaften40.

Um mögliche Glykosylierungsdiskrepanzen zwischen CHO-produzierter löslicher S-Ektodomäne und S-VLP zu untersuchen, führten wir LC-HCD-MS/MS-Assays durch und untersuchten Glykane, die an 20 von 22 potenziellen N-Glykosylierungsstellen des S-Proteins auf S-VLPs vorhanden waren oder als lösliches, rekombinantes Ektodomänentrimer (SmT2v3) ebenfalls aus CHO-Zellen hergestellt. Bei beiden Probentypen waren die N-Glykosylierungsstellen meist mit komplexen Glykanen sialyliert und kernfucosyliert, die tendenziell biantennär oder triantennär waren. An bestimmten Stellen wurde häufig ein hoher Mannosegehalt beobachtet, und an einigen anderen Stellen wurden auch geringe Mengen an Hybridglykanen beobachtet (Abb. 3d und ergänzende Abb. 3b). Ein großer Unterschied zwischen löslichem und VLP-S wurde bei N1194 festgestellt. Die Glykosylierungsstelle N1194 auf dem VLP-S wurde mit mutmaßlichen N-Acetyllactosamin (LacNAc)-Wiederholungen glykosyliert, die in SmT2v3, in dem diese Stelle größtenteils unbesetzt war, nicht nachgewiesen wurden (Abb. 3d). Nach unserem besten Wissen gibt es keine Berichte über eine biologische Funktion, die mit der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Glykans bei N1194 in Zusammenhang steht. Insgesamt ergaben unsere Analysen, dass die Glykosylierung des VLP-assoziierten und löslichen S-Proteins ziemlich ähnlich ist (Abb. 3d und ergänzende Abb. 3b) und mit der Glykosylierung des löslichen S-Proteins vergleichbar ist, das von HEK293F-Zellen sowie SARS-CoV- produziert wird. 2 Virion-assoziiertes S, produziert von Vero-Zellen36,41,42.

Im Gegensatz dazu kann sich die S-Glykosylierung bei Proteinen und VLPs, die in anderen Produktionswirten produziert werden, die für die Impfstoffherstellung verwendet werden, deutlich unterscheiden. Nicotiana-benthamiana-Pflanzen, die von Medicago für die Produktion von VLPs verwendet werden, erzeugen S mit Glykanen, die als mutmaßliche Pflanzenallergene bekannt sind43,44,45. Außerdem produzieren Insektenzellen wie Sf9, die zur Herstellung von Novavax- und Sanofi S-basierten Impfstoffen verwendet werden, Glykoproteine mit hauptsächlich hohen Mannose-, Oligomannose- und Paucimannose-Glykanen (letztere können auch einen immunogenen α1,3-verknüpften Kern-Fucose-Rest enthalten). )45,46,47,48. Weitere Studien sind erforderlich, um den Einfluss dieser Glykanstrukturen auf die Immunogenität des S-Proteins aufzuklären. Die APC-Verarbeitung und Präsentation eines S-Proteins, das immunogene Glykane oder Glykane enthält, die normalerweise nicht auf SARS-CoV-2-Virionen vorkommen, an B-Zellen kann die Immunantwort auf Epitope umlenken, die nicht vor dem natürlichen Virus schützen.

Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass CHO-produzierte S-VLPs eine höhere Dichte an S-Proteinen auf ihrer Oberfläche aufweisen als das in Vero-Zellen produzierte native Virus mit einer ähnlichen Glykosylierung wie zuvor für S, das von menschlichen und Vero-Zellen produziert wurde (als lösliche Ektodomäne). oder mit Viruspartikeln assoziiert).

Das Potenzial von S-VLPs als Impfstoffantigene, allein oder in Kombination mit Adjuvantien, wurde in In-vivo-Modellen von Mäusen und Hamstern bewertet. Mäuse wurden zuerst am Tag 0 immunisiert und dann am Tag 21 mit VLPs allein (enthaltend 3 µg S-Protein) oder in verschiedenen Dosen (3, 0,3 oder 0,06 µg S-Protein) mit Adju-phos oder AS01b-Adjuvantien geboostert. Die Analyse von Serumproben vom 28. Tag zeigte, dass VLPs auch ohne Adjuvans Anti-S-Antikörper induzierten, aber bereits 60 ng VLPs induzierten Titer, die >4-fach höher als das Antigen allein waren, wenn sie mit Adjuvans mit Adjuvans versetzt waren, und >23-fach höher mit AS01b (Abb. 4a). IFN-γ ELISpot zeigte, dass spezifische T-Zell-Antworten durch VLPs+AS01b bei allen getesteten Dosen stark hervorgerufen werden, durch Antigen allein mäßig, aber in Kombination mit Adju-phos gehemmt (Abb. 4b). Ein Ersatzneutralisationstest unter Verwendung des S-Proteins des Vorfahrenstamms23 zeigte eine erhebliche Variabilität der Neutralisationsaktivität mit Serum aus den Gruppen VLP und VLP+Adju-phos (Abb. 4c). Im Gegensatz dazu erreichte das Serum aus der VLPs+AS01b-Gruppe angesichts der in unserem Protokoll verwendeten Verdünnung die maximale neutralisierende Aktivität gegenüber dem Referenzstamm S. Beta-, Delta- und Omicron BA.4-5S-Proteinvarianten wurden auch mit der niedrigsten getesteten Dosis von 60 ng wirksam durch Serum von Mäusen neutralisiert, die mit VLPs + AS01b immunisiert waren (ergänzende Abbildung 4). Basierend auf diesen Ergebnissen kommen wir zu dem Schluss, dass VLPs+AS01b bei Mäusen eine starke humorale und zelluläre Immunantwort gegen die ursprünglichen und verschiedene Virusstämme hervorruft. Umgekehrt lösten VLPs und VLP+Adju-phos spezifische IgGs aus, waren jedoch tendenziell weniger immunogen und hatten keine oder eine weniger starke neutralisierende Aktivität. Wichtig ist, dass VLP+Adju-phos die zelluläre Reaktion zu beeinträchtigen scheint (Abb. 4b). Daher haben wir beschlossen, dieses Adjuvans nicht weiter zu testen.

a* Titer der humoralen Immunantwort (Gesamt-Anti-Spike-IgG) bei geimpften Mäusen mit verschiedenen S-VLP-Formulierungen. Der geometrische Mittelwert der Anti-S-Titer (GMT) am Tag 28 wurde von der naiven und der behandelten Gruppe mittels ELISA bestimmt. b* Quantifizierung von Spike-spezifischen T-Zellen. Isolierte Splenozyten von mit S-VLP-Formulierungen geimpften Mäusen wurden mit einer Spike-Peptidbibliothek co-inkubiert. Die Quantifizierung der IFN-γ+-sekretierenden Zellen wurde mit ELISpot durchgeführt und die Ergebnisse wurden als Mittelwert von IFN-γ+/106 Splenozyten ausgedrückt. c** Zellbasierter (hACE2-HEK293T) Ersatzneutralisationstest. Der prozentuale Neutralisierungsmittelwert für SARS-CoV-2 wurde anhand von Verdünnungen von 1:25 unter Adjuvans- und Adju-Phos-Bedingungen oder 1:75 unter AS01b-Bedingungen bestimmt. a–c Die Daten werden als geometrisches Mittel ± SEM (10 Mäuse pro Gruppe) dargestellt. Schwarze Punkte stellen naive Tiere dar, blau für unadjuvantierte Tiere, rot für Adju-Phos und grün für AS01b-S-VLPs. d Veränderung des Körpergewichts bei immunisierten Hamstern, die mit SARS-CoV-2 (Vorfahrenstamm) infiziert sind. Das Liniendiagramm stellt die täglichen Körpergewichtsmessungen von naiven und geimpften Tieren nach der Exposition dar. e** Virusquantifizierung durch Plaque-Assay. Plaque-bildende Einheiten (PFUs) wurden in Vero-E6-Zellen quantifiziert, die mit Hamsterlungenhomogenaten infiziert waren. Die Viruslast (log10) wird in PFU pro Gramm Lunge angezeigt. f** Quantifizierung viraler RNA in der Lunge von Hamstern. RNA-Proben von naiven und geimpften Tieren wurden fünf Tage nach der Exposition einem viralen RNA-Nachweis mittels RT-qPCR unterzogen. Die SARS-CoV-2-RNA-Konzentration wird in gRNA-Kopien/Lunge (log10) angezeigt. d–f Die Daten werden als Mittelwert ± SEM (6 Tiere pro Gruppe) dargestellt. Schwarze Punkte (graue Balken) stellen naive Tiere dar, Blau steht für S-VLPs ohne Adjuvans, Orange für AS01b und Grün für S-VLPs+AS01b. *Zur Beurteilung der Signifikanz wurde eine einfaktorielle ANOVA mit mehreren Vergleichstests nach Tukey oder **Dunnette durchgeführt. p ≤ 0,0001, p ≤ 0,001, p ≤ 0,01 und p ≤ 0,05 werden durch vier, drei, zwei bzw. ein Sternchen dargestellt, und p > 0,05 gilt als nicht signifikant (NS).

Als nächstes bewerteten wir den Schutz durch Immunisierung mit S-VLP-Formulierungen in einem Hamster-Challenge-Modell. Nach zwei Impfstoffdosen und anschließender Infektion mit SARS-CoV-2 wurde bei der VLPs+AS01b-Gruppe im Vergleich zu den nicht geimpften Kontrollgruppen und den VLP-Gruppen ohne Adjuvans eine deutliche Verringerung des Gewichtsverlusts beobachtet (Abb. 4d). Dementsprechend zeigte ein Lungenhomogenat-Plaque-Assay eine dramatisch verringerte SARS-CoV-2-Viruslast in der VLPs + AS01b-Gruppe und eine geringere, aber bemerkenswerte Verringerung bei Tieren, die VLPs ohne Adjuvans erhielten (p = 0,0003) (Abb. 4e). Unterschiede in den viralen RNA-Spiegeln waren weniger ausgeprägt, mit einem bemerkenswerten Unterschied nur in der VLPs + AS01b-Gruppe (p = 0,015) (Abb. 4f), was wahrscheinlich auf Unterschiede in der RNA und der Kinetik der Virusausscheidung/-clearance zurückzuführen ist, wie in geimpften und ungeimpften Kohorten berichtet49 . So bestätigten Modelle in vivo, dass S-VLPs+AS01b eine starke Th1/Th2-Reaktion hervorriefen und Tiere vollständig vor einer SARS-CoV-2-Infektion schützten, selbst bei niedrigen Dosen im Nanogrammbereich.

Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass S-VLPs + AS01b immunogener sein könnten als die meisten VLP-Impfstoffe, die sich derzeit in der präklinischen oder klinischen Phase befinden. VBI-2902a verwendete Dosen von 0,2 und 1 µg adjuvantiertes S-Protein aus Gag-S-basierten VLPs, um neutralisierende Antikörper zu induzieren bzw. Schutz in Mausmodellen zu gewähren9. VLPs, die durch den Zusammenbau von 4 Strukturproteinen (SMEN) von SARS-CoV-2 entstehen, benötigen 2,83 μg adjuvantiertes Antigen, um neutralisierende Antikörper (EC50) in Mäusen zu produzieren4. ABNCoV2 induziert mithilfe der Split-Protein-Tag/Catcher-Technologie, bei der in Insektenzellen produziertes S RBD mit einem in E. coli produzierten kapsidähnlichen Bakteriophagen-AP205-Partikel verknüpft wird, neutralisierende Aktivität in präklinischen und klinischen Studien unter Verwendung von 6,5 oder ≥ 6 µg adjuvantiertem Antigen , bzw.50,51. Darüber hinaus erforderte eine wirksame Impfstoffdosis von Medicago-Covifenz beim Menschen eine Primärdosis von 3,75 µg und eine ähnliche Auffrischungsdosis VLP-S10. Bemerkenswerterweise zeigt unsere Studie, dass S-VLPs in Maus- und Hamstermodellen nur eine Dosis von 0,06–0,3 µg S-Protein benötigen, wenn sie mit AS01b als Adjuvans versehen werden, um eine starke neutralisierende Aktivität zu induzieren und gleichzeitig einen Schutz gegen die SARS-CoV-2-Exposition zu bieten.

Zusammenfassend haben wir im Gegensatz zu zuvor veröffentlichten Arbeiten mit anderen zellbasierten Expressionsplattformen4,9,10,27,50,51,52 herausgefunden, dass die Expression von SARS-CoV-2 S allein in CHO-Zellen ausreicht, um die Assemblierung zu induzieren und Freisetzung reichlich vorhandener S-beschichteter VLPs mit hoher Dichte. Im Vergleich zu alternativen VLP-Technologien zeigen S-VLPs nicht nur eine ähnliche oder bessere In-vivo-Wirksamkeit, sondern ermöglichen auch vereinfachte Upstream-Produktions- und Downstream-Reinigungsprozesse, was eine kostengünstige Herstellung in großem Maßstab ermöglichen sollte. Wir gehen davon aus, dass von CHO produzierte S-VLPs eine kostengünstige und flexible Impfstoffplattform bieten könnten, um die aktuelle Pandemie, einschließlich zukünftiger besorgniserregender SARS-CoV-2-Varianten, weiter zu bekämpfen.

Die in dieser Arbeit verwendeten VLP-Kodierungssequenzen von M, E und S sind über GenBank verfügbar (NCBI-Referenzsequenz: NC_045512.2). Mutationen in der S-Proteinsequenz zur Erzeugung von S-VLPs werden im Abschnitt „Methoden“ ausführlich beschrieben. Ergänzende Informationen enthalten die folgenden Details. Ergänzende Abbildung 1: Erzeugung verschiedener S-VLP-Typen. Ergänzende Abbildung 2: Quantifizierung und Größenbestimmung von S-VLPs durch NTA. Ergänzende Abbildung 3: Schätzung der S-Proteindichte auf der Partikeloberfläche und S-Glykosylierungsanalyse. Ergänzende Abbildung 4: Zellbasierter (Vero E6) Ersatzneutralisationstest für SARS-CoV-2-Varianten. Ergänzende Abbildung 5: Digitale, unbeschnittene Bilder von Gelen und Blots. Darüber hinaus enthält die Zusatzinformationsdatei zusätzliche Methoden, die im vorliegenden Manuskript verwendet werden. Die für Glykosylierungsstudien generierten Daten sind in der Zusatzdatendatei 1 enthalten. Die numerischen Daten, die den Abbildungen zugrunde liegen. 2b, f, g, 3b und 4 finden Sie in der Zusatzdatendatei 2. Alle anderen Daten sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Wir danken Dr. Warren Kett von Avitide Inc. für die Bereitstellung des AVIPure-COV2S VLP-Affinitätsharzes. Dies ist eine NRC-Veröffentlichung #NRC-HHT_53654A.

Human Health Therapeutics Research Centre, National Research Council Canada, 6100 Royalmount Avenue, Montreal, QC, H4P 2R2, Kanada

Sergio P. Alpuche-Lazcano, Matthew Stuible, Julie Blouin, Jean-Sébastien Maltais, Brian Cass, Daria Zoubchenok und Yves Durocher

Human Health Therapeutics Research Centre, National Research Council Canada, 1200 Montreal Road, Ottawa, ON, K1A 0R6, Kanada

Bassel Akache, Anh Tran, Tyler M. Renner, Renu Dudani, Diana Duque und Michael J. McCluskie

Human Health Therapeutics Research Centre, National Research Council Canada, 100 Sussex Dr, Ottawa, ON, K1A 0R6, Kanada

John Kelly, Anna Robotham, Arsalan Haqqani und Alexandra Star

Forschungszentrum für die Entwicklung aquatischer und pflanzlicher Ressourcen, National Research Council Canada, 6100 Royalmount Avenue, Montreal, QC, H4P 2R2, Kanada

Sabahudin Hrapovic

Forschungszentrum für Nanotechnologie, National Research Council Canada, 11421 Saskatchewan Drive, Edmonton, AB, T6G 2M9, Kanada

Kai Cui, Jae-Young Cho und Xinyu Wang

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SPA-L., MS und YD haben die Studie konzipiert. Klonierung, Expression, Reinigung, SDS-PAGE, Western Blot und ELISA von VLPs wurden von SPA-L., J.-SM, MS, BC und JB durchgeführt. Biophysikalische Charakterisierung von VLPs (NTA, EM, Spike-Modellierung auf VLP-Oberfläche, usw.) wurde von SH, SPA-L, DZJ-YC, KC und XW durchgeführt. Spike-VLP-Glykosylierungsanalysen wurden von AR, AH, AS und JK durchgeführt. Tierstudien wurden von BA, TMR, RD, MJM durchgeführt und analysiert , DD und AT Das Manuskript wurde von SPA-L., MS und YD verfasst und von SPA-L., MS, YD, BA und TMR überprüft

Korrespondenz mit Yves Durocher.

SPA-L., MS und YD erklären die Einreichung einer vorläufigen Patentanmeldung (Patentname: ENVELOPED VIRUS LIKE PARTICLES COMPRISING SARS-COV-2 S PROTEIN, Anmeldenummer: PCT/IB2023/057279, Status der Anmeldung: Patent Cooperation Treaty ( PCT-Antrag, geografische Region: Antrag an PCT für internationale Anmeldung). Das vorliegende Manuskript beschreibt den Einsatz von S-VLPs als Impfstoffkandidat gegen SARS-CoV-2. Die übrigen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Communications Medicine dankt Xin He, Maren Schubert, Kok Lian Ho und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Alpuche-Lazcano, SP, Stuible, M., Akache, B. et al. Präklinische Bewertung herstellbarer SARS-CoV-2-Spikevirus-ähnlicher Partikel, die in Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters hergestellt werden. Commun Med 3, 116 (2023). https://doi.org/10.1038/s43856-023-00340-7

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Eingegangen: 16. März 2023

Angenommen: 25. Juli 2023

Veröffentlicht: 23. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s43856-023-00340-7

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